تشخيص بعض الأمراض البكتيرية التي تصيب التفاحيات
يتم تشخيص الأمراض البكتيرية باتباع عدة خطوات أهمها :
1- أعراض المرض : تعد الأعراض التي تحدثها البكتيريا على النبات ,النقطة الأولى لتشخيص المرض , وعلى مشخص الأمراض البكتيرية أن يكون عارفا ًبكل المظاهر المختلفة التي تحدثها البكتيريا على النبات . وتكتسب هذه المعرفة بالخبرة التي تتم بفحص المظاهر الممرضة أولاُ يتبعها عزل المسبب وتحديد هويته ثانياُ .
فأعراض مرض التدرن التاجي الذي تسببه البكتيريا Agrobacterium tumefaciens تبدو على شكل أورام سرطانية توجد على أجزاء مختلفة من النبات ( الجذور , منطقة التطعيم , الساق , الجذور ...) وتختلف هذه الأورام في الحجم ,فقد تبدو صغيرة بحجم رأس الدبوس , وقد يصل وزن بعضها إلى عدة كيلو غرامات .
أما مرض الجذر الشعري Agrobacterium rhizogenes فإنه يدفع النبات لتكوين جذور كثيفة رهيفة تبدو كخصلة من الشعر, تنتج عن انقسام غير طبيعي لخلايا النبات .
مرض اللفحة النارية : يسبب موت الباقات الزهرية,تقرحات وجفاف للأفرع , ظهور إفرازات بكتيرية ,تلون النسيج ما تحت القلف بالون الأحمر الرطب , انحناء قمة الطرود بشكل العكاز .
التقرح البكتيري على التفاحيات ( جفاف أزهار الأجاص ) Pseudomonas syringae pv.syringae : يسبب موت وجفاف أزهار الأجاص بعد صقيع ربيعي ,كما يحدث تقرحات وموت للأفرع دون ظهور إفرازات بكتيرية .
2- عزل البكتيريا : يعتمد نجاح عزل البكتيريا الممرضة للنبات على حسن اختيار الجزء النباتي الذي يحتوي على أعداد كبيرة من البكتيريا الممرضة وغياب أو وجود عدد قليل من البكتيريا الرمية وهدا يتحقق ب :
أ- اختيار الأعراض الواضحة والنسيج النباتي المحاذي لمنطقة الإصابة .
ب- تعقيم النسيج النباتي المصاب بواسطة الكحول أو هيبوكلوريد الصوديوم ثم يغسل النسيج بالماء المقطر والمعقم عدة مرات .
ت- تقطع بواسطة مشرط معقم رقائق صغيرة من النسيج النباتي في المنطقة الحدودية للإصابة .
ث- توضع الشرائح في طبق بتري يحتوي 5ميليترات ماء مقطر ومعقم وثم تجزأ إلى قطع صغيرة بوساطة المشرط .
ج- يترك النسيج النباتي المسحوق في الماء لمدة 15-60 دقيقة لتحرير البكتيريا من النسيج المصاب وانتشارها في النسيج المصاب .
ح- يتم امتصاص كمية من معلق النسيج النباتي المسحوق بوساطة ماصة باسنور .ثم توضع قطرة من هذا المعلق ( 1/20 ميليلتر ) في طبق بتري يحوي بيئة مغذية صلبة ( LPGA) ومقسم خارجياُ إلى ثلاثة قطاعات . توضع قطرة المعلق في القطاع الأول ثم تنشر بوساطة أبرة الزرع ,بشكل خطوط حلزونية على كامل سطح القطاع ,ثم تنشر في القطاع الثاني بحيث تتعامد مع خطوط النشر في القطاع الأول مع الخطوط في القطاع الثاني ,يستمر النشر في القطاع الثالث بالطريقة نفسها حتى منتصفه , ويكمل النشر على باقي القطاع بخطوط لا تتعامد مع خطوط القطاع الثاني .
خ- تحضن الأطباق على درجة حرارة تتراوح ما بين 25- 27 م .ثم تفحص يومياُ لملاحظة سرعة ظهور المستعمرات وشكلها ولونها , يتم انتخاب مستعمرة واحدة تمثل البكتريا الممرضة وتزرع في أنبوب اختبار يحوي بيئة مغذية (LPGA) مائلة تحفظ فيها البكتريا بشكل مزرعة نقية تستخدم لاحقا لتحديد طبيعتها ونوعها . ويعطى لهذه المزرعة البكتيرية رقماُ أو رمزاُ يدل عليها , وتدون في دفتر العزل الصفات المورفولوجية للمستعمر المأخوذة .
3 – العدوى الاصطناعية : تهدف العدوى الاصطناعية إلى تحديد قدرة البكتيريا على إحداث الأعراض المرضية على المضيف الذي تم عزل البكتيريا منه أو على مضيفات أخرى أسهل تداولاُ .
أ- العدوى على ثمار التفاح أو الأجاص :
تستخدم لتحديد القدرة الإمراضية لبكتيريا اللفحة النارية ,حيث تؤخذ ثمار غير ناضجة (8-10 أسابيع قبل القطاف ) وبقطر 4 –5 سم . تمسح بالكحول 95 0/0 ثم تقطع إلى شرائح بسماكة 5‚ 0 – 1 سم . توضع كل شريحة في طبق بتري يحوي ورق نشاف مبللاُ بالماء المقطر والمعقم . ثم يوضع على الشريحة قطرة من معلق بكتيري على حدود غلاف البذرة . تحضن الأطباق على درجة 26 م لمدة 5 أيام حيث تفحص الشرائح يومياُ لمشاهدة ظهور إفرازات بكتيرية على سطح الشرائح كما قد يلاحظ تلون نسيج الثمرة باللون البني .
ب- العدوى ببكتيريا التدرن التاجي : تجرى العدوى على المضيف الذي عزلت منه البكتريا وإذا كان ذلك غير ممكن من الناحية العلمية فيمكن أن تجرى العدوى على نباتات أخرى عشبية أسهل استخداماً كنبات البندورة ,وعباد الشمس ونبات الداتورة .
1-تنمى النباتات المستخدمة في العدوى حتى طور خمسة أوراق .
2-يحضر معلق بكتيري كثيف من مزرعة بكترية عمرها 24- 48 ساعة .
3- يصنع بواسطة مشرط شق طولي ( واحد سم ) يصل إلى نخاع النبات .
4- توضع قطرة حجمها 1/20 ميليلترا من المعلق المحضر ( ثلاث نباتات لكل سلالة , ثلاثة جروح على كل نبات ).
5-تجرى العدوى نفسها باستخدام ماء مقطر ومعقم كشاهد .
6-توضع النباتات على درجة24-25م .
7-يلاحظ بعد 3 –4 أسابيع بدء ظهور انتفاخات في أماكن العدوى .
ج- العدوى ببكتريا الجذر الشعري :
ويمكن التأكد من قدرة البكتريا على إحداث هذه الظاهرة مخبرياً بإجراء العدوى على الجزر وتتم باتباع الخطوات التالية :
1-اغسل جذور الجزر السليمة ظاهرياً بالماء والصابون .
2-عقم سطحها الخارجي بالكحول .
-قطع جذر الجزر إلى أقراص سماكة القرص 2-3سم .
4-ضع الأقراص في أطباق بتري تحوي بيئة آغار الماء . واحرص على أن يكون
السطح العلوي للقرص ملامساً للآغار .
5-ضع على أقراص الجزر الموضوعة في أطباق بتري قطرة من معلق بكتيري
تركيزه كثيف تجنب وضع كمية زائدة من المعلق أوتلوث الآغار .
6- حضن الأطباق على درجة24م نهاراً و18 ليلأ .
7-لاحظ بعد 12-15 يوماً بدء ظهور جذور على أقراص الجزر .
ح – اختبار فرط الحساسية على التبغ :
يجرى هذا الاختبار للتأكد من أن البكتريا المعزولة تكون ممرضة للنبات , ويتم الاختبار بحقن معلق من البكتريا المراد اختبارها بوساطة محقن ( سير ينج ) يتم الحقن إلى جانب العصب الرئيسي للورقة أو أحد الأعصاب الثانوية , حيث يسمح هذا الحقن بترشيح المعلق البكتيري ضمن نسيج الورقة الذي يجب إن تكون مساحة الجزء المحقون لا تقل عن 1 –2 سم . بعد 24 ساعة من الحقن يلاحظ موت وذبول النسيج النباتي الذي لامس البكتريا .
3- الاختبارات المناعية :
أ- إنتاج الأمصال : يتم إنتاج الأمصال بتحضير ما يسمى بمولدات الأضداد(antigen ) , وهذا يكون بتحضير معلق بكتيري كثيف ثم تثفيله بمثفلة سرعتها 5000 دورة في الدقيقة ,ثم يغسل الراسب بماء مقطر ومعقم ويثفل مرة أخرى ,يحل الراسب المتكون في كمية من الماء المقطر والمعقم لتشكيل معلق بكتيري يستخدم في حقن أرنب عن طريق وريد الأذن أو عن طريق العضل أو تحت الجلد خلال فترة زمنية (30 – 40 ) يوم ضمن برنامج للحقن . يعاير تركيز الأجسام المضادة في مصل دم الحيوان , وعندما يصل إلى التركيز المطلوب , يؤخذ دم الحيوان بعد ذبحه ثم يفصل مصل الدم عن الخثرة ,يثفل المصل للتخلص من بقابا الكريات الحمراء , ويحفظ بعدها على درجة – 20 م لحين الاستخدام .
ب- التشخيص باستخدام طريقة الوميض المناع(IF )immunofluorescent
تعد طريقة الوميض المناعي أكثر طرائق التشخيص استخداما من قبل العاملين بالأمراض البكتيرية حيث تشاهد نتائج التفاعل تحت المجهر .
مبدأالطريقة : تعتمد هذه الطريقة على قابلية بعض المركبات الوميضية
للاتحاد مع الأجسام المضادة . وعندما يتحد مزيج منها مع البكتريا فإنه يشاهد
تحت المجهر باستخدام مصدر ضوئي بالأشعة فوق البنفسجية وبوجود
مرشحات للضوء .
تبدوا البكتيريا التي اتحد معها المصل محاطة بهالة وميضية . وهناك طريقتان
تستخدمان لهذا الغرض .
1- الطريقة غير المباشرة الأكثر استخداما:
وتقوم على تغليف البكتريا بالأجسام المضادة المتشكلة في جسم الأرنب
ثم يعامل هذا الغلاف باجسام مضادة متشكلة في جسم الغنم أو الماعز
بعد حقنها بمصل دم أرنب . والأجسام المضادة المنتجة في جسم الغنم أو الماعز هي التي تمزج بالصبغة (FITC ) ويستطيع هذا المزيج أن يتحد مع أي Ig مستحضر من الأرنب . وعند استخدام طريقة الوميض المناعي فأن هذا المزيج سوف يتحد مع الأجسام المضادة الملتصقة بالبكتريا ، وهذا يسمح برؤيتها باستخدام المجهر المزود بالأشعة فوق البنفسجية ، ونظرا لإمكان اتحاد مزيج مصل الغنم والماعز المحضر والصبغة الوميضية مع أي مصل أرنب ،
يجعل للطريقة غير المباشرة ميزة كبيرة ،حيث لم يعد بحاجة إلى مزج
كل مصل أرنب محضر بالصبغة الوميضية . وقد أصبح من الممكن
الحصول على FITC المرتبطة . بمصل الغنم أو الماعز تجاريا .
طريقة العمل :
1- استخدام شرائح ذات نوافذ أو حلقات متعددة ( 12 حلقة بقطر 7
مم)أو أرسم على شريحة مجهرية حلقات دائرية بقلم حافر على الزجاج
قطر كل منها 7 مم.
2- انشر على الدوائر معلقاُ بكتيريا خفيفا تركيز
3- اترك الشريحة حتى تجف .
4- ثبت البكتريا إما بتمرير الشريحة على لهب مصباح بنزن أو بتغطيتها
بكحول نقي لمدة 10 دقائق .
5- مدد المصل بالماء الفيزيولوجي إلى التمديد الذي أعطى أفضل النتائج
مع المعلق البكتيري المعتمد .
6-ضع قطرات كبيرة من المصل (20-25 ميكروليترا) على كل دائرة
أو حلقة واتركها لمدة 30 دقيقة .
7-تخلص من كمية المصل الزائدة ثم اغسل بالماء الفيزيولوجي .
8- ضع الشريحة في حوضين يحويان ماء فيزيولوجيا لمدة 5 دقائق
في كل حوض وعلى التوالي .
9- جفف السطح العلوي والسفلي للشريحة بورق نشاف .
10-مدد المصل الذي يرتبط مع الصبغة الوميضية إلى التمديد المنصوح
به1/50 – 1/400 .
11- ضع قطرة كبيرة من هذا المصل على كل دائرة ( 20 – 25 )
12- تخلص من المصل واغسل الشريحة بالماء الفيزيولوجي .
13- ضع الشريحة في وعاءين يحويان ماء فيزيولوجيا لمدة 5 دقائق في كل وعاء .
14- جفف الشريحة بورق التشريح .
15- ضع قطرة صغيرة من الغليسيرين الممزوج بمحلول فيزيولوجي
( 10 ميكروليترا )على السطح السفلي للساترة ، ثم ضعها فوق المحضر
وافحص تحت المجهر المزود بالأشعة فوق البنفسجة بالتكبير العالي أو بالعدسة
الزيتية الغاطسة . تبدو البكتريا وميضية بلون أخضر مصفر .
16- يستخدم في هذا لاختبار شاهدان :
1- سالب : غشاء بكتيري غير معامل بمصل يحوي الأجسام المضادة للبكتريا
ت- موجب : غشاء بكتيري من البكتريا التي استخدمت في تحضير المصل .
2- طريقة الانتشار المضاعف :
يقوم هذا الاختبار على مبدأ انتشار كل من الاجسام المضادة ومولدات
الأضداد المنحلة ضمن السائل في هلام الآغار . وعندما تلتقي الأجسام
المضادة ومولدات الأضاد بنسب متكافئة يتكون راسب أبيض .
تحضير الهلام :
1- حضر محلول 8. 0 0/0 من ألأغار النقي أو الآغار أو التريبتون
في محلول بوفر فيزيولوجي .
2-أضف إلى المحلول 5. 0/ 0 أزيد الصوديوم كمانع للتلوث .
3- سخن المحلول على حمام مائي حتى تمام ذوبان المواد.
4 صب المحلول في أطباق بتري (15 ) ميليرا لكل طبق ) أو على
شرائح مجهرية بحيث تكون سماكة الأغار تساوي 2-3مم
5 تقطع من الهلام وترفع ست اسطوانات صغيرة ليتكون مكانها حفر قطر
كل منها 4 مم كما تقطع من المركز اسطوانة أخرى لتشكل
حفرة بقطع 4 أ و5مم تكون هذا الحفر على مسافات متساوية من الحفر
المجاورة
تحضير المعلق البكتيري
1-تنمى البكتريا على بيئة مغزية مناسبة
2-يحضر معلق بكتيري كثف ضمن محلول بوفر فيزيولوجي
3-يستخدم المعلق البكتيري مباشرة أو يمكن أن يحفظ على درجة حرارة منخفضة بعد إضافة 5,0 % أزيد الصوديوم.
طريقة العمل :
1- يوضع نحو 50 ميكرو ليتراً من مصل الدم في الحفرة المركزية.
2- يوضع في حفرتين متقابلتين 50 ميكرو ليتراً من معلقة البكتريا المستخدمة في تحضير المصل .
3- يضاف إلى الحفر الأربع معلق من البكتريا يراد اختبارها .
4- تغطى أطباق اابتري , كما توضع الشرائح في حيز مغلق ذي رطوبة عالية وتحضن على درجة 20 مْ لمدة 24 ساعة .
يلاحظ بعد فترة التحضين تكون راسب أبيض على شكل قوس بين الحفرة المركزية والحفرة المحيطية كل قوس يعبر على معقد ناتج عن تركيز مثالي بين مولدات الأضداد والأجسام المضادة .
فإذا كانت الأقواس المتشكلة متماثلة كلها فإن ذلك يشير إلى تماثل تام بين البكتريا المختبرة أما إذا ظهر نتوء صغير من أحد الأقواس دون أن يتحد مع قوس السلالة المجاورة فهذا يدل على أن نوعي البكتريا متشابهان جزئياً ، أما إذا تصالبت الأقواس ولم يظهر أي اتحاد فيما بينهما فذلك دليل على اختلاف كبير بين نوعين البكتريا.
