إجراءات زراعة الأنسجة العامة
8 - إجراءات لزراعة الأنسجة العامة General procedures
***********
أ- تحضير البيئة Stocks and media preparation
ب- اختيار نبات الأم Selective of mother plants
جـ- اختيار المنفصل النباتى Choice of Explant
د – تعقيم المنفصل النباتى Sterilization and washing of the explant
هـ- نقل الجزء المستعمل لسطح البيئةTransfer of the explant to the medium
و – الظروف البيئية للمزرعة Culture environment
ط- تخليق الأعضاء أو الكشف المورفولوجى Morphogenesis
ك – تقسية النبات قبل النقل للتربة Hardening of plants
أ – تحضير البيئة Stocks and media preparation :
أولا: تحضير Stocks
تشمل تلك الخطوة إعداد Stock من مكونات البيئة المختلفة وتخزينها على درجة 4 – 5 م لحين استعمالها وذلك لتوفير الوقت والجهد اللازم لوزن الأملاح والفيتامينات والهرمونات الواجب تواجدها فى لتر من البيئة الغذائية . وسوف نسوق مثالاً لتحضير بيئة Murashige & turck ويتم ذلك بوزن وزنة كبيرة من كل ملح تساوى عشرة أضعاف الكمية لتحضير لتر من البيئة . وعند تحضير البيئة يؤخذ منها عشر حجمها فقط فعند تجميع تلك الكميات من Stocks المختلفة نحصل على التركيزات المطلوبة لتحضير لتر من البيئة . هذا بالنسبة للأملاح أما بالنسبة للفيتامينات فيوزن من كل فيتامين 100 ملليجرام تذاب فى 100 مل ماء مقطر وعند الاستعمال يؤخذ واحد مل من هذا Stock والذى يعنى احتوائه على مليجرام من الفيتامين أو الهرمون . وتجدد Stock مرة كل شهر . ويجب الأخذ فى الاعتبار أن الهرمونات لا تذوب فى الماء فالكينتين مثلاً يذوب فى محلول قلوى أما البنزيل أدنين فلا يذوب فى الماء ويذوب فقط فى حمض الهيدروكلوريك أما الأكسين فيذوب فى الكحول أو هيدروكسيد البوتاسيوم.
جدول ( 8) يوضح مثالاً لتحضير Stocks مختلفة لبيئة Murashige & Turck
Item
Compound
Stock solution
Use 1/L
Final concentration
A
CaCl2.2H2O
4.4 g/100 ml
10
440
B
NH4NO3 KNO3
16.5 g/1000 ml
19.0 g/1000 ml
100
1650
1900
C
MgSO4 3.7 g
10
370
MnSO4
0.17 g/100 ml
170
ZnSO4
0.086 g
8.6
CuSO4
0.05 ml
0.025
D
KI
CoCl2
1 ml prestock
0.25 ml prestock
10
0.83
0.025
E
KH2PO4
H3BO3
NamoO4
1.7 g
0.062 g
0.25 ml prestock
10
170
6.2
0.25
F
FeSO4
NaEDTA
0.278 g
100 ml
0.372 g
27.85
37.25
add EDTA to hot water stir in FeSO4 for 1/2 hr,
Prestocks ( all 100mls )
CuSO4.5H2O
KI
CoCl2.6H2O
NaMoO4.2H2O
100 mg/100 ml
830 mg/100 ml
100 mg/100 ml
1 g/100 ml
Murashige - Skoog Medium (1962)
Organic salts
M(u) moles/L medium
Nitrates ( make I L, use 100 ml stock / L medium)
Compound
Amount / stock
Stock Conc.
20.6 m
NH4 NO3
KNO3
16.500 mg/L stock
19.000 mg/L stock
16.5 mg/ml
19.0 mg/ml
20.6 m
18.8 m
Sulfates [make 100 m1, use 10 ml stock /L medium
Compound
Amount I stock
Stock Conc.
MgSO4.H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
3700 mg/l00 ml stock
169 mg/l00 ml stock
86 mg/l00 ml stock
0.25 ml/100 ml stock
37.0 mg/ml
1.69 mg/ml
0.86 mg/ml
0.0025 mg/ml
1.5 m
100 u
30 u
0.1 u
Halides [make 100 ml, use 10 ml stock I L medium (l00X)
Compound
Amount / stock
Stock Conc.
CaCl2.2H2O
KI
CoCl2.6H2O
4400 mg/I00 ml stock
8.3 mg/l00 ml stock
0.25 ml/100 ml stock
44.0 mg/ml
0.083 mg/ml
0.0025 mg/ml
3 m
5 u
0.1 u
P, B, Mo (make 100 ml, use 10 ml stock / L medium (100X)]
Compound
Amount / stock
Stock Conc.
KH2 PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
1700 mg/l00 ml stock
62 mg/I00 ml stock
2.5ml/100 ml stock
17.0 mg/ml
0.62 mg/ml
0.025 mg/ml
1.3 m
100 u
1.0 u
NaFe EDTA (make 100 ml, use 10 ml stock/ L medium (100X)]
Compound
Amount/ stock
Stock Conc.
FeSO4.H2O
Na2EDTA
278 mg/l00 ml stock
373 mg/100 ml stock
2.78 mg/ml
3.73 mg/ml
100 u
100 u
use mls of prestock below
Stocks (make 100 ml)
Stock Concentration
CuSO4.5H2O
CoCl2.H2O
Na2MoO4.2H2O
1 mg/ml
1 mg/ml
1 mg/ml
C. Organic constituents
1. Vitamins ( make 100 ml, use 1 ml stock / L medium )
Compound
Stock Concentration
Thiamine HCl
Pyridoxine HCl Nicotinic Acid
Glycine
0.1 mg/ml
0.5 mg/ml
0.5 mg/ml
2.0 mg/ml
0.3 u
2.4 u
4.1 u
26.6 u
2. Myo-inositol ( make 100 ml , use 10 ml/L medium )
Compound
Stock Concentration
Myo-inositol
10 mg/ml
555 u
ثانيا: تحضير البيئة :
- يؤخذ 10 مل من F,E,D,C.A stock ثم 100 مل من Stock B ثم تجمع فى كأس سعته لتر ويوزن السكر ( 30 جرام / لتر ) وتذاب ثم تضاف الفيتامينات من Stock المحضر سابقاً بأخذ 0.5 مل من Stock الـ Pyridoxine ومل من Thiamine و2 مل من Glycine ، 0.5 مل من Nicotinic acid ، 10 مل من Inositol ثم تضاف الهرمونات بالتركيزات المطلوبة من 1 – 30 مليجرام / لتر IAA و 0.4 إلى 10 مليجرام / لتر كينتين ثم يضاف 1 جرام من Casein hydrolysate
- تتم الإذابة باستخدام المقلب المغناطيسى Magnetic stirrer ويكمل الحجم للتر وتجمع ربع تلك الكميات عند الرغبة فى تحضير 1/4 لتر أو نصفها عند الرغبة فى تحضير 1/2 لتر فقط .
- يضبط الـ PH بإضافة نقط من محلول الصودا الكاوية 0.1عيارى أو حمض الهيدروكلوريك 0.1عيارى حتى تصبح البيئة ذو pH 5.7 + 0.1 وقد تستعمل البيئة ذات pH 6.0 فى حالة زراعة الجذور.
- يضاف الأجار بتركيزات من 0.6 إلى 1 % ويذاب على حمام مائى درجة حرارته 100 م° لمدة 20 : 30 دقيقة ثم توزع البيئة على الأنابيب أو الدوارق وتغطى بأغطية الأنابيب أما الدوارق فتغطى بقطن غير ماص أو بورق ألومنيوم . وعند الرغبة فى استعمال الأطباق يتم صب الأطباق بعد التعقيم وليس قبله كما فى حالة الأنابيب أو الدوارق وتعقم الأطباق مسبقاً فى الفرن على 180 م° لمدة 3 ساعات ويجب عدم صب البيئة فى الأطباق بعد إخراجها مباشرة من الأتوكلاف حتى لا يتكون بخار الماء على سطح الطبق والذى يتساقط فيما بعد على سطح البيئة.
- تعقم البيئة بالأتوكلاف على 1 كجم / سم2 لمدة ربع ساعة ترتفع فيها درجة الحرارة إلى 121 م° ويجب عدم فتح الأتوكلاف أو فتح صنبور البخار إلا بعد نزول الضغط حتى لا يتسبب انخفاض الضغط المفاجئ فى غليان البيئة وتطايرها وكذلك تطاير الأغطية أو السدادات ويجب عدم هز الأنابيب أو الدوارق بعد خروجها من الأتوكلاف مباشرة ولكن بعد فترة يستحسن رج البيئة حتى تتجانس البيئة فى محتواها من الأجار حتى لا يتصلب الجزء القاعدى من البيئة ويصبح الجزء العلوى مائى . ويجب مراعاة أن GA يعقم بالترشيح ( باستخدام الفلتر ) نظراً لأنه يهدم بالحرارة وبعد التعقيم يحقن داخل أنابيب البيئة الذائبة مع الأخذ فى الاعتبار أن تكون حرارة البيئة لا تزيد عن 50 م°حتى لا يهدم GA .
- فى حالة الرغبة فى استعمال البيئة السائلة يركب كوبرى من ورق الترشيح على سطح البيئة السائلة داخل الأنابيب حتى يتسنى ارتكاز الجزء المزروع عليه.
- أما إذا استخدمت الدوارق فيستعمل هزاز لإمداد الأنسجة بالأكسجين اللازم ويكون سرعة الهز من 70: 150 rpm.
- ويجب ألا تزيد حجم البيئة بالنسبة للإناء أو الأنبوبة عن الثلث حتى يسمح بالتهوية الجيدة .
- فى المرحلة الأولى Stage І من زراعة الأنسجة يستعمل بعض المضادات الحيوية لوقف النمو الميكروبى كما تضاف بعض مضادات الأكسدة Antioxidants وذلك لمنع عملية التلوين باللون البنى Browning والتى تؤدى إلى تدهور النسيج الحديث المتكون أو المزروع .
التلوين البنى Browning
إن الأنسجة النباتية النامية على البيئة الغذائية لا تقوم باستنفاذ المواد الغذائية فحسب بل تفرز مواد أخرى تتراكم فى البيئة مثل الفينولات والتى تسبب التلون البنى نتيجة أكسدتها وتكون Guinones التى تعتبر سامة للأنسجة ويعتقد بعض الباحثين إلى أن التثبيط الناتج عن التلون البنى يرجع إلى ربط الفينولات للبروتين وبذلك تفقد الأنسجة نشاط بعض الأنزيمات أو أنها تعمل كمعاون إنزيمى Coenzyme لبعض إنزيمات الأكسدة مثل IAA oxidase والكتاليز والبيروكسيديز والتى تعمل على هدم الأوكسينات . وهناك عوامل مساعدة على التلون باللون البنى مثل ارتفاع قيمة الـpH من 2.5 إلى 5.6 وكذلك ارتفاع درجة الحرارة داخل كابينة العزل وكذلك الإضاءة. وللتغلب على ذلك يضاف للبيئة حمض الأسكوربيك أو حمض الستريك كذلك من المفيد نقع الجزء المستعمل فى محلول مانع للتلوين البنى Pre-soaking of explants يتكون هذا المحلول من 150 مليجرام / لتر حمض ستريك و100 مليجرام / لتر حمض الأسكوربيك . كذلك استعمل فى نخيل البلح محلول آخر يتكون من Caffeine بتركيز 1 جرام / لتر بالإضافة الى Polyvinylpyroledone بتركيز 1 جرام / لتر أيضاً , وقد استخدمت المادة الأخيرة بإضافتها إلى البيئة مباشرة بتركيز 100 مليجرام / لتر .
كذلك وجد أن إضافة الفحم النشط Active charcoal (Ac) بمعدل 0.3 – 3 جرام / لتر يؤدى إلى امتصاص المركبات المثبطة التى يفرزها النبات. فقد وجد weatherhead واخرين 1978 أن الفحم النباتى النشط قام بإدمصاص 5- Hydroxymethyl furfural وهذا المركب عادة ينتج من تحلل السكروز عند التعقيم بالأتوكلاف وهو مركب مثبط كذلك وجد Friedberg واخرين 1984عند زراعتهم لأجزاء نبات الجزر البرى Wild Carrot أن الفحم النشط فى الوسط الغذائى أدى إلى عدم وجود حمض الخليك الفينولى وحمض البنزويك والذى تفرزه الأنسجة المزروعة وذلك بإدمصاصها لهذه المركبات .
ب- اختيار نباتات الأم Selective of mother plants
يجب أن يكون نبات الأم فى حالة صحية جيدة وفى بداية نشاطه وذو صفات جيدة خالي من الأمراض خاصة الفيروسية ويجب أن يكون قد خرج من طور الراحة إذا كانت Explant لها طور راحة مثل الأبصال والكورمات والدرنات وذلك بإستيفاء الاحتياجات الحرارية المرتفعة أو المنخفضة لكسر طور راحتها قبل استخدامها فى زراعة الأنسجة .
جـ- اختيار الجزء الذى يستخدم فى الزراعة " المنفصل النباتى " Choice of Explant
الأجزاء التى تستخدم فى زراعة الأنسجة هى الجذر Roots, السيقان Shoot , أجزاء الزهرة Flower parts , أجزاء من الثمار ، البتلات Petioles ، العقد Nodes ، البذور Seeds ، حبوب اللقاح Pollen grain , المتوك Anther , المبيض Ovulary ، الأجنة Embryo ، السويقة Epicotyls , Hypocotyls ، نسيج النيوسيلة Nucellus الإندوسبرم Endosperm ، الفلقات Cotyledons , القشرة Cortex ، النخاع Pith ، الكمبيوم Cambium وهى الأجزاء المحتوية على مرستيمات أو أنسجة قابلة للتحول إلى الحالة المرستيمية ولكل نبات نسيج ما يكون أكثر ملائماً وراثياً من غيره وهو ما يطلق عليه Maximum genetic stability لإعطاء المنفصل النباتى الملائم Explant لزراعتها بهذه التقنية لإعطاء أفضل النتائج . وفيما يلى أمثلة الاجزاء المستخدمة فى الزراعة للنباتات المختلفة.
الجزء المستخــدم
النبــات
القمة النامية
الجذور والسيقان
نسيج البنيوسيلة
السويقة الجنينية
السويقة الجنينية
المتوك والسيقان
الأوراق والسيقان
النخاع والجذور
العتر
البطاطا
الموالح
القرعيات
اللوبيا
الداتورة
الدخان
الجزر
هناك عدة اعتبارات من الواجب النظر إليها قبل اختيار الجزء المزروع وهى:
· - نوع العضو الذى سوف يؤخذ منه النسيج: لتقرير أى الأنسجة تكون أنسب للاستخدام يجب أن يتم هذا بناء على اختبار وتجربة وقد لوحظ أن القمم النامية هى العضو الأكثر ملاءمة فى كثير من النباتات مثل الأسبرجس والجربيرا وشرائح من الجذور فى نباتات العائلة Convolvulaceae والأوراق كما فى Begonia وبعض أفراد عائلة Solanaceae ونسيج النيوسيلة فى نباتات عائلة Rutaceae والمتوك كما فى الدخان .
- الحالة الفسيولوجية للمنفصل النباتى: لوحظ أن اختلاف الأعضاء فى قدرتها على التخليق Regeneration تعتمد فى كثير من الأحيان على الاختلافات الفسيولوجية وعمر النسيج ودرجة تخليقه وتميزه فعلى سبيل المثال عند زراعة قطاعات من الساق Stem section من الدخان قريب من منطقة القمة النامية فقد انتج كل من الجذور والسيقان العرضية بسهولة فى حين أخذ الـ Explant نفسها من قاعدة الساق بعيداً عن القمة لم تكون مثل تلك الأعضاء وتكون نسيح الكلس فقط. ونفس الملاحظة وجدت فى نبات Echeveria فعند أخذ Explant من الأوراق الحديثة فإنه أمكن تخليق الجذور عليها فقط بينما أعطت Explant المأخوذ من الأوراق القاعدية Shoots فقط فى حين انتجت الـ Explant المأخوذ من الأوراق الوسطية كل من الجذور والسيقان العرضية معا. وفى نبات Lunaria annua فإن الجذور تكونت على Explant المأخوذة من أعناق الأوراق الصغيرة ولم تتكون إذا أخذت من الأوراق القديمة فى العمر . وقد اقترح Pierik 1967 أن تكوين الجذور بصعوبة على Explant المأخوذة من أوراق كبيرة فسيولوجياً يرجع إلى تكون مثبطات لخروج الجذور بتلك الأوراق Root inhibiting substances .
· - حجم الجزء المستعمل: بصفة عامة فإن استخدام منفصل نباتى ذو حجم صغير يجعل احتمالية نجاحه فى الوسط الغذائى ضعيفة. ففى دراسة على نبات القرنفل وجد أن زراعة أجزاء من القرع بطول 0.09 ملليميتر لم يكن لها القدرة على التكوين الشكلى Morphogenesis أما الأجزاء الأطول المأخوذة من منطقة تحت النسيج القمى وبطول 0.2 مل كان لها قدر قليلة جدا على النمو فى حين الاجزاء بطول 0.35 ملليميتر أعطت أعداد كبيرة من النموات وازدادت بزيادة عدد بادئات الأوراق Leaf primordia على الجزء المزروع Explant وعندما كان حجم النسيج 0.5 مل فإن عدد الأفرع المتكون قد انخفض نتيجة لوجود الأنسجة تحت النسيج القمى الضعيفه فى قابليتها على التخليق والنمو.
· - موسم أخذ المنفصل النباتى: يؤثر الموسم الذى يأخذ منه Explant على تطور وتخليق الأعضاء على المنفصل النباتى عند زراعة الأنسجة فقد لوحظ أن تخليق الأعضاء من أجزاء منزرعة من نبات Solanum tuberasum يتأثر بالموسم فإذا أخذ المنفصل النباتى فى شهر ديسمبر إلى فبراير كان إنتاج الأبصال In vitro أعلى مما لو أخذت Explant فى الفترة من فبراير إلى نهاية مارس وتكون النتائج فقيرة جداً إذا نزع المنفصل النباتى وزرع فى الفترة من مايو إلى إبريل وحتى نوفمبر.
· - العمر الفسيولوجى للمنفصل النباتى: إن العمر الفسيولوجى للأجزاء النباتية Explant يؤثر بصورة مباشرة فى نوع واتجاه التكوين المورفولوجى فالأجزاء النباتية الحديثة والأقل تميزاً التى توجد فى منطقة الأنسجة المرستيمية تعطى نجاح بدرجة أعلى من تلك المتقدمة فى العمر . فقد لوحظ أن Explant المأخوذة من نبات فى حالة طفولة للنباتات المعمرة الخشبية تكون أقدر على التخليق مما لو أخذت من نبات ناضج وعموماً ففى النباتات الخشبية Woody plants يعتبر الجنين Embryo وأنسجة البادرات ذات قابلية عالية على إعادة التكوين . أما النباتات التى يختلط فيها الأنسجة المرستيمية مع الأنسجة البالغة فيمكن دفع النباتات للحصول عليها وذلك بالتقليم الجائز Can be forced by pruning أما النباتات التى لا تحتوى على أنسجة فى حالة مرستيمية فيمكن إعادة بعض أنسجتها الناضجة إلى أنسجة مرستيمية وذلك بتطعيم قمة مرستيمية من نبات ناضج على أصل فى حالة طفولة أو المعاملة بالجبرلين أو بزراعة الأنسجة على بيئات يزداد فيها تركيز السيتوكينين .
أعلى الصفحة
د- تعقيم المنفصل النباتى Sterilization
يغسل الجزء النباتى المستعمل تحت تيار من ماء الجارى لمدة ساعة هذه الطريقة تقلل من نسبة التلوث إلى درجة كبيرة وإذا كان السطح الخارجى مغطى بطبقة شمعية فإن غسيل الجزء المنفصل بإحدى مساحيق الغسيل Detergent يساعد على جعل السطح الخارجى أكثر قابلية للتبلل ومن فوائد استخدام تيار الماء قبل إجراء التعقيم هو جعل البكتريا والفطريات أكثر تأثيراً بعملية التعقيم التالية مما يسهل من فاعليته .
تعقيــم الأنسجــة: تنقع الأنسجة المفصولة فى كحول إيثانول بتركيز 70 % لمدة خمس دقائق و لا تزيد فى فترة تعريض الأنسجة للكحول حتى لا يؤدى ذلك إلى نزع الماء من الخلايا وجفافها Dehydration ، ثم تغمس الأنسجة فى محلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 1% لمدة 5 – 30 دقيقة حسب حساسية الأنسجة ومن المفضل إضافة نقطتين من مادة Tween 20 لزيادة فعل مادة التعقيم . ثم تغسل الأنسجة بماء مقطر معقم ثلاث مرات حتى يتم التخلص من كل آثار المواد المستعملة فى التعقيم مثل الكلورين أو كلوريد الزئبق .
وفيما يلى جدول يبين تأثير مواد التعقيم المختلفة وصفاتها:
جدول (9 ) مقارنة بين تأثير التعقيم المختلفة وصفاتها
التأثير
فترة التعقيم بالدقيقة
سهولة الإزالة
التركيز المستخدم
مادة التعقيم
جيد جداً
جيد جداً
جيد
جيد جداً
جيد
مقبول
جيد
5 – 30
5 – 30
5 - 15
2 – 10
5 – 30
2 – 10
30 – 60
+++
+++
+++++
+++
+
+
++
9 – 10 %
2 %
10 – 12 %
1 – 2 %
1 %
0.1 – 1 %
4 – 5
- هايبوكلورايت الكالسيوم
- هايبوكلورايت الصوديوم
- بيروكسيد الهيدروجين
- ماء البرومين
- نترات الفضة
- كلوريد الزئبق
- مضادات حيوية
تعقيــم البــذور: تعقيم البذور ينفس طريقة تعقيم الانسجة السابقة الذكر وقد تعقم البذور بغمسها فى محلول كلوريد الزئبق بتركيز 0.1 % لمدة 30 دقيقة. وقد تغمس البذور فى كحول 95 % ثم تحرق سريعاً على لهب فيتم التعقيم السطحى للبذور .
هـ - نقل الجزء المستعمل لسطح البيئة Transfer of the explant to establishment medium
يتم نقل النسيج المستعمل بعد تعقيمه على سطح البيئة المعقمة مسبقاً فى الأتوكلاف باستخدام أدوات معقمة أما فى الفرن الكهربائى على 180 °م لمدة ثلاث ساعات أو فى الأتوكلاف على 121 م°لمدة ربع ساعة أما الأدوات اليدوية " أدوات الترشيح " فتنغمس فى كحول وتشعل على اللهب بين الحين والآخر كذلك يستخدم لهب بجوار الأنابيب والزجاجات الحاوية على البيئة, فكما هو معروف أن حيز 30 سم3 حول اللهب يكون خالي من الكائنات الدقيقة التى توجد فى الجو.
يتم أيضاً نقل الجزء المستعمل إلى سطح البيئة فى جو معقم وهو جو داخل كابينة التعقيم Laminer flow ويمكن تعقيم غرفة كاملة تسمى غرفة العزل باستخدام أبخرة الفورمالين أو الأبخرة المتصاعدة من تفاعل الفورمالين مع برمنجنات البوتاسيوم أو باستخدام لمبة الأشعة فوق البنفسجية U/V .
عند نقل المنفصل النباتى على سطح البيئة التى تكون فى آحدى صورها الثلاثة, الأولى هى الصورة الصلبة Solid أو شبه صلبة وترجع صلابتها إلى إضافة الأجار , أما الصورة الثانية فهى السائلة غير المتحركة Stationary liquid وهى التى لا يضاف اليها الاجار فتظل سائلة ويستخدم معها كوبرى من ورق الترشيح مغمور طرفه فى البيئة السائلة لكى نتمكن من وضع الجزء النباتى Explant على سطح الكوبرى أما الصورة الثالثة فهى السائلة المتحركة Agitated liquid media والأخيرة نحصل عليها بهز الآنية المحتوية على البيئة الغذائية السائلة باستخدام Shaking machine والطريقة الأخيرة تلغى كل سلبيات الطريقتين السابقتين حيث تؤدى إلى تبادل الغازات وتقضى على الاستقطاب للأجزاء النباتية بفعل الجاذبية الأرضية وقضى على ظاهرة نقص بعض العناصر من الوسط الغذائى نتيجة عدم انتشارها .
وقد وجد أن النجاح والفشل فى زراعة الأنسجة فى كثير من الحالات يعتمد على استخدام البيئة سائلة أو شبه صلبة والأمثلة على ذلك كثيرة . وقد وجد أن نبات Cattleya لا يتم زراعة الأنسجة بنجاح إلا إذا زرع على بيئة سائلة فى حين أن نبات Asparagus و Gerbera يتطلب بالضرورة الزراعة على بيئة الأجار Agar gill medium وقد يتطلب الأمر أن تتم الزراعة فى Stage І على بيئة سائلة بينما Stage Ш, П على بيئة أجار أو Stage П, І على بيئة سائلة بينما Stage Ш على بيئة صلبة. ومبكراً لاحظ White 1939 أن كلس الدخان يتخلق عندما ينقل من بيئة الأجار إلى البيئة السائلة وقد وجد أن طبيعة البيئة الغذائية تلعب دور معنوى فى تحديد نوع العضو المتخلق فعند عزل جذور Cichorium وجد Bounial & Margare 1958 أن Explants المنزرعة على بيئة سائلة وموضوعة على كوبرى من ورق الترشيح أنتجت براعم خضرية فى حين أن Explant المنزرعة على بيئة الأجار قد خلقت براعم زهرية وأن نسبة الأجار يجب ألا تقل عن 2.4 % لاعطاء أعلى نسبة من تخليق البراعم الزهرية .
وقد اقترح White 1939 أنه ربما يكون تدرج الأكسجين بين نوعى البيئة الصلبة أو السائلة هو المحدد والمنظم لنشأة الأعضاء ثم اكتشف Skoog 1944 أن تخليق Shoots على البيئة السائلة يحدث فقط عندما تركت البيئة فى الظلام أو تحت إضاءة ضعيفة ولم تحدث عندما عرضت لإضاءة عالية .
وجد Kessil 1972 أن تخليق الأجنة والنموات الخضرية والناتجة من زراعة الجزر يزداد عندما يقل المتاح من الأكسجين بينما تخليق الجذور يتطلب وفرة من الأكسجين هذه النتيجة الهامة تؤيد اقتراح White المبكر والسابق الذكر .
وجد أن استخدام الأجار له أهمية كبيرة من حيث تركيزه وجودته فى إعطاء الصلابة فقد وجد Romberger & Tabor 1971 أن زراعة القمم المرستيمية لنبات Picea abies تتأثر تأثراً معنوياً بجودة الأجار وأن النمو يكون جيداً إذا استعمل أجار Difco ( purified ) agar وكان فقير إذا استعمل Difco noble agar وكانت النتائج متوسطة عند استعمال Difco bacto agar
أما عن تركيز الأجار فهو هام لإعطاء صلابة هلامية ذات قوام مناسب والتركيز المستعمل يختلف باختلاف الجزء المستعمل ونوع الأجار ودرجة حموضة البيئة وعموماً بزيادة الحموضة يزداد لين البيئة أما عن التركيزات العالية فهى غير مستحبة لأنها تعطى البيئة قواماً صلباً يؤدى إلى عدم نجاح الزراعة. وعند نقل الـ Explant يجب التأكد من التلامس الجيد وقد تغمس Explant فى البيئة لثلثها تقريباً . وعند وضع Explant على البيئة السائلة بدون استخدام كوبرى من ورق الترشيح توضع الدوارق المستعملة على هزاز أفقى يهتز بمعدل من 100 – 150 Rotating per minute " rpm " ويستعمل معدل أبطأ من ذلك عند تخليق الأعضاء من 70 – 120 rpm.
منقول
